Benutzer Diskussion:Nico/RNA World FAQ

FAQ

in vivo

Im lebenden Organismus.

in vitro

im Reagenzglas.

psychrophilen bzw.thermophilen

Psychrophil: kälteliebend. Diese Organismen benutzen auf DNA und RNA Ebene A-T (DNA) bzw. A-U (RNA) reiche Codons (merke: A=T/U Interaktion bedeutet zwei Wasserstoffbrückenbindungen; G=C Interaktion hingegen drei Wasserstoffbrückenbindungen, also stabiler bei höherer Temperatur). Im Verlauf der Evolution reichern psychrophile also AU Basenpaarung in RNA an, während thermophile GC Basenpaarungen anreichern, damit in beiden Fällen die betreffende RNA funktioniell bleibt (Kovarianzprinzip!). Thermophil: hitzeliebend

Was sind CRISPR Elemente?

Das CRISPR-System stellt eine simple Form eines adaptiven Immunsystems in Bakterien dar. Es wirkt dadurch, das eindringende Nukleinsäuren - z.B. von Phagen in das Bakterium injiziertes Genom - von ncRNAs gebunden und inaktiviert wird. Die Vielfalt der CRISPR ncRNAs bestimmt also, wie verteidigungsfähig das Bakterium ist.

Was sind miRNAs?

miRNAs sind kleine, normalerweise 22 nt lange einzelsträngige RNA Moleküle, die in Eukaryonten also globale Genregulatoren dienen. Man kennt inzwischen über 1000 verschiedene miRNAs. Die mRNAs wichtiger Proteine haben in ihrem 3'UTR Regionen, an die diese miRNAs sequenzspezifisch binden können. Die Bindung einer miRNA steuert entweder die Stabilität der gebundenen mRNA (normalerweise Abbau des Messengers, wenn die miRNA gebunden ist) oder die Translation der mRNA (also die Produktion des von der betreffenden mRNA kodierten Proteins). Sinn des ganzen ist die Koordination zusammengehörender Gene. mRNA-Produktion wird durch die Aktivität ihrer Promotoren auf der DNA gesteuert. Die Produktion der Proteine von diesen mRNAs kann von miRNAs drastisch beeinflusst werden. Wird das Netzwerk der miRNA Produktion gestört, finden ENtwicklungsprozesse u.U. nicht mehr statt oder es entwicklen sich Krebszellen (ungesteuertes Wachstum).

Was ist RNA Interferenz (Nobelpreis!)?

Prinzip der miRNA Funktion. Eine miRNA interferiert mit der Produktion des von ihr über die entsprechende mRNA addressierten Proteins.

Gibt es Beispiele für Viren, die miRNAs als Genregulatoren mitbringen?

Ja, z.B. HIV.

Was sind Ribozyme?

Ein Ribozym ist eine katalytisch aktive RNA. Eine ncRNA also, die analog zu Enzymen (katalytisch aktives Protein) funktioniet, aber eben kein Protein, sondern eine RNA ist. Das Ribosom ist ein Ribozym. Ebenso die RNase P.

Was haben wir davon, wenn wir Homologe von schon bekannten RNA Familien identifiziert und tabelliert haben?

Wir können Bereiche auf sequenzierten Genomen, die bislang in ihrer Funktion nicht zugeordnet waren, ncRNAs zuordnen (Genomannotierung).

Wozu kann man den RNA World Supercomputer denn noch so einsetzen?

Anwendungsgebiete sind die folgenden:

• Genomannotierung. Nachdem ein neues Genom sequenziert wurde, möchte man wissen, was es denn nun kodiert. Man annotiert es also, will heissen man beschreibt im Kopfteil der Genomsequenzdatei, welche Bereiche für was zuständig sind. Proteine lassen sich sehr einfach annotieren, da sie immer mit ATG/GTG/TTG beginnen und in Tripletts gelesen (Leseraster: immer drei Basen = 1 Codon) auf TAA/TGA/TAG enden. Bei RNAs gibt es diese Start- und Stop-Signale nicht. Und da liegt das Problem. Zur Annotierung gibt es keine einfach anwendbare Computermethode - außer die Suche nach BEKANNTEN RNA Familien mittels RNA Kovarianzmodellen. Dieses wenden wir hier an und zwar systematisch, d.h. wir nehmen ALLE bekannten RNA Familien, basteln uns ein Kovarianzmodell, kalibrieren dieses und durchsuchen mit dem kalibrierten Kovarianzmodell ALLE volständig sequenzierten Organismen. Die gefundenen ncRNAs tabellieren wir in unserer Ergebnisdatenbank und schreiben nach Überprüfung diese Ergebnisse in das Genomfile hinein.
• Identifizierung neuer ncRNA Familien. Dazu gibt es zwei Wege. Der experimentelle Weg ist der, die gesamte RNA aus einem Organismus zu isolieren und zu sequenzieren (Gerät dazu ist ein "high throughput" (HT) Sequencer, wie z.B. der GS Junior von Roche (günstigstes Gerät am Markt). Kostenpunkt 250.000 Euro; HT Sequenzerung eines Gesamttranskriptoms eines Bakteriums kostet typischer Weise 1000-4000 Euro). Dann vergleicht man die Sequenzen mit dem Genom und ordnet zu, welche Teile der RNA Transkripte nun mRNAs sind (diese enthalten die annotierten proteinkodierenden Bereiche) und welche eben etwas anderes sind. Dies sind die ncRNAs. Es gibt Labore, die machen dies am laufenden Band und wissen dann nichts damit anzufangen. Will heißen: Viel wird sequenziert, wenig Bedeutung wird erkannt. Ein erster Schritt besteht im Einsatz von RNA World: ein ncRNA Transkript wird genommen, eine Sekundärstruktur zugeordnet, ein Kovarianzmodell gebaut, dieses kalibriert und damit erneut alles an Genomen durchsucht. Als Ergebnis erhält man die Antwort, ob die RNA etwas universell vorkommendes ist oder ob es ein Einzelfall ist. Problem: Wie bekommt man die Sekundärstruktur? Dazu gibt es zwei Wege: Entweder man sagt sie mittels mehr oder weniger cleveren Computermethoden vorher, nimmt einfach an sei sei korrekt und setzt sie ein (RNA World sagt einam dann schon, ob die Struktur richtig war oder nicht) oder man Produziert die ncRNA im Labor, reinigt sie und bestimmt experimentell die Sekundärstruktur. Hierzu ist besonders die HT SHAPE Methode von Bedeutung, die in Kevin Weeks Labor maßgeblich mit vorangetrieben wurde. Sie beruht darauf, dass man die RNA aggressiven Chemikalien aussetzt, die nur dort RNA "kaputtmodifizieren" können, wo Nukleotide an der Oberfläche der RNA liegen. An die inneren Regionen kommen die Chemikalien nicht heran. Dann nutzt man eine sogenannte Primerextensionreaktion mit der man von der modifizierten RNA cDNA mit Hilfe einer reversen Transkriptase herstellt. Der Primer, den man dazu vorlegt, trägt ein Fluoreszenzlabel und kann in einer Kapillarelektrophorese mit Fluoreszenzdetektor "gesehen" werden. Die Modifikationsreaktion wird so angelegt, dass nur ein Teil der RNA modifiziert werden kann. Statistisch ist das Ganze so ausgeklügelt, dass pro RNA Molekül in der Reaktionsmischung nur eine Modifikation vorkommt. Eine RNA, bei der alle Nukleotide für die Chemikalie zugänglich sind, wird also am Ende der Reaktion ein cDNA Gemisch geben, das alle Längen von einem Nukleotid bis hin zur RNA Gesamtlänge enthält. Diese werden nach Größe per Kapillarelektrophorese getrent und am Ende der Machine per Detektor identifiziert. Auf diese Weise kann man die Sekundärtstruktur bestimmen, da man nur an nichtbasengepaarten Positionen eine Modifikation erhält. Man hat am Ende also eine Tabelle, welche Nukleotide einzelsträngig und welche gepaart sind. Dann kann man manuell relativ einfach zuordnen, was womit paart.

Zurück zum Thema: Der ander Weg ist, dass man alle intergenischen Regionen einfach als ncRNA annimmt und mittels RNA World prüft, ob diese Regionen in anderen Organismen ebenfals kovarianztechnisch konservert sind - wenn ja, ist die Wahrscheinlichkeit ca. 90%, dass tatsächlich eine neue ncRNA gefunden wurde. Auf diese Weise kann man ganz neue RNAs finden. Es wird bisher nicht gemacht, weil kein Rechencluster diese Aufgabe in annehmbarer Zeit bewältigen kann. RNA World kann.

• RNA Strukturvohersage. Hat man eine ncRNA gefunden, kann man deren Struktur vorhersagen und diese Vorhersage erneut mittels HT SHAPE validieren - oder mittels NMR- und Kristallographiemethoden.
• RNA World kann z.B. die bekannten CRISPR Veteidigungssysteme von Bakterien erschöpfend identifizieren und somit sagen, gegen welche Phagen das jeweilige Bakterium resistent ist. Dann nehmen wir einen dieser Phagen, ändern sein Genom im Labor so, dass er den Bereich, denn das CRISPR Element attackiert nicht mehr hat und schon kann dieser Phage möglicherweise als Therapeutikum gegen z.B. MRSA, Mycobakterium, uvm. eingesetzt werden.
• RNA World kann systematisch feststellen, welche Viren welche bekannten miRNAs mitbringen. Auf diese Weise kann zugeordnet werden, wo das betreffende Virus eingreift. Es lassen sich - so meine Hoffnung - Regulationspfade identifizieren, die mit Labormethoden wenn überhaupt nur aufwändig zugänglich wären.

Was ist Genomannotierung?

Genome annotation: The process of identifying the locations of genes and all of the coding regions in a genome and determining what those genes do. An annotation (irrespective of the context) is a note added by way of explanation or commentary. Once a genome is sequenced, it needs to be annotated to make sense of it.

Was ist ein RNA Pseudoknoten?

Ein RNA Pseudoknoten ist eine RNA Sekundärstruktur, die aus zwei Haarnadelstrukturen besteht, bei der die Schleife des ersten Stammes einen Teil des zweiten bildet. Pseudoknoten wurden das erste Mal 1982 in einem Mosaikvirus (TYMV, turnip yellow mosaic virus) entdeckt.[2] Pseudoknoten falten sich in knotenförmige dreidimensionale Gebilde, die aber keine echten topologische Knoten darstellen.

Biologische Bedeutung [Bearbeiten]

Einige wichtige biologische Prozesse basieren auf RNA-Molekülen, die Pseudoknoten bilden. Beispielsweise beinhaltet die menschliche Telomerase einen Pseudoknoten, der essentiell für die Aktivität des Enzyms ist.[1] Die Telomerase ist ein Enzym des Zellkerns, welches aus einem Protein- (TERT) und einem langen RNA-Anteil (TR) besteht. Dieses Enzym stellt die Endstücke der Chromosomen, die so genannten Telomere, wieder her. Die Enzymaktivität der Telomerase lässt sich durch die TRAP-Methode feststellen.

Wie lang sind die Laufzeiten von Infernal-Subprogrammen auf Standard PCs?

CMCALIBRATE: wenige Minuten bis 300 Stunden auf einem Intel P8600 Prozessor mit 2,4 GHz CMSEARCH: wenige Minuten bis gut 100 Stunden (selber CPU Typ) CMBUILD: wenige Sekunden bis einige Minuten - abe rnur bei Benutzung der Voreinstellunegn. Will man genaz genau Modelle haben, geht es in die Stunden. CMALIGN: Ähnlich wie CMBUILD.

Was bedeutet 5'UTR?

Untranslatierter Randbereich am 5' Ende des mRNA Moleküls, der keine Proteine kodiert (also zwischen Transkriptionsstart und Translationsstartcodon). Das Synonym am 3' Ende (zw. Translationsendcodon und Transkriptionsende) wäre 3'UTR. UTRs haben fast immer regulatorische Funktion. Die 3'UTRs eukaryotischer mRNAs sind die Orte, an denen miRNAs binden und die Translatierbarkeit bzw. Stabilität der mRNA steuern. 5'UTRs enthalten in Bakterien sehr häufig sogenannte Riboswitches. Das sind RNA Regionen, die wie Proteine eine genau definierte Faltung/Struktur haben und kleine Moleküle (z.B. Metabolite) binden. Nach Bindung ändert sich die Struktur des Riboswitches und wirkt somit als eine Art molekularer Schalter. Die cspA mRNA von E. coli besitzt im 5'UTR (160 nt Länge) eine PSeudoknotenstruktur, die als Thermosensor dient, d.h. temperaturabhängig eine andere Struktur einnimmt. Je nach Temperatur wird so die Proteuktion des cspA kodierten Kälteschockproteins gesteuert: wenig CspA bei 37°C, sehr, sehr viel CspA bei 15°C.

Wofür kodiert E. coli cspA?

Für das Hauptkälteschockprotein CspA, welches zu einer universelle vorkommenden Familie von kleinen, RNA-bindenden Proteinen gehört. E. coli besitzt 9 Kopien dieses Gens von denen jedes für ein ca. 7 kDa (70 Aminosäuren) großes Protein kodiert. Alle 9 Kopen haben Sequenzvariationen und teilweise ähnliche (CspA, CspB, CspG, CspI RNA Chaperon, transkriptionelle Antiterminatoren), teilweise völlig andere (CspD: Replikationsinhibitor) Funktion. Die CSP Proteinfamilie ist der Prototyp der RNA-bindenden Proteine und besteht aus der CSD c(old shock domain) - einem schon in den frühesten bekannten Bakterien vorkommenden Proteinfaltungsmodul. In allen dahingehend getesteten Organismen ist die Existenz mindestens eines CSD Ptoeins essentiell für das Überleben.

Wieviele Maschinen sind an RNA World angeschlossen?

7000

Was ist die Peakperformance von RNA World?=

potential: 15TFlop, real: 4,2TFlop

Was bedeutet HT Transkriptomsequenzierung?

Hochdurchsatztranskriptomsequenzierung (HT= high throughput, Hochdurchsatz-). Das Transkriptom einer Zelle ist die Gesamtheit aller von ihr produzierten RNA Moleküle.

Was bedeutet HT SHAPE RNA Analyse?

Eine Hochdurchsatz-(=HT)-Methode zur RNA Sekundärstrukturanalyse, bei der die Zugänglichkeit jedes einzelnen Nukleotids mittels aggressiver Chemikalien geprüft, die Produkte amplifiziert (reverse Transkriptase mit fluoreszenzgelabelten Primern) und über Kapillarelektrophorese nach Größe Sortiert werden. Am Ende erhält man eine Tabelle, welche Reste einzelsträngig sind, welche basengepaart, welche an der Oberfläche liegen und welche im inneren der RNA verborgen sind.

Was ist Kapillarelektrophorese?

Eine Methode zur GröÃ?ensortierung von Molekülen, bei der die geladenen Moleküle (RNA/DNA) in einer gelgefüllten Kapillare getrennt und am Ende der Kapillare mittes Fluoreszenzdetektor identifiziert werden.

Was ist 6S RNA?

Die 6S RNA ist eine bakterielle, nicht-proteinkodierende RNA von ca. 200 nt Länge. Sie bilded eine Struktur ähnlich einem Stäbchen mit einer flexiblen Schleifenregion in der Mitte. An diese Schleifenregion bindet die RNA Polymerase in einer Weise, die ähnlich der Bindung an DNA ist. Allerdings kann die RNA Polymerase von der 6S RNA nicht wieder "abspringen", wenn im Cytosol nicht ausreichend Nukleotide vorhanden sind. In Zeiten geringer Nährstoffverfügbarkeit dient die 6S RNA somit zur "Speicherung" bzw. Inaktivierung der RNA Polymerase. Sobald wieder genügend Nährstoffe vorhanden sind und somit auch wieder reichlich Nukleotide im Cytosol synthetisiert worden sind, nutzt die RNA Polymerase die 6S RNA analog zur DNA als Templat zur Sytnese eines kleinen Transkripts von ca. 20 nt Länge (GröÃ?e ähnlich der miRNAs). Es wird vermutet, dass dieses TRanskript (ncRNA) regulatorische Funktionen haben könnte.

Dot-Bracket-Sekundärstrukturrepräsentation

Eindimensionale Schreibweise zur Darstellung von RNA-Sekundärstrukturen im Computer.

pseudoknotenenthaltende RNAs

Ein Pseudoknoten ist z.B. die Basenpaarung der Schleifenregionen zweier Haarnadelschleifen.

RNase P in Aquifex aeolicus

RNase P ist ein lebenswichtiger Ribonukleoproteinkomplex (RNP; ebenso wie das Ribosom, welches aus 3 ncRNAs und über 50 Proteinen besteht), der für die Prozessierung von reifen tRNAs aus deren Vorläufertranskripten (pre-tRNAs) essentiell ist. In Bakterien besteht RNase P aus einer etwa 400 nt langen ncRNA und einem ca. 14 kDa (140 Aminosäuren) groÃ?en Protein.

Bakteriophagen

Viren, die spezifisch nur Bakterien befallen.

MDR humanpathogene Bakterien (MRSA)

MDR: "multi drug resistant" MRSA: methicillin- bzw. multiresistente Staphylococcus aureus Bakterien (antibiotikaresistent; der neue Schrecken der Krankenhausinfektionen)